本方法适用于总长度（载体+所有片段）不超过20kb的重组实验。目的片段引物设计与PCR扩增建议使用高保真酶进行目的片段的PCR扩增，并摸索退火温度，优化反应体系和程序。

载体线性化

1. 双酶切：同时选择两种限制性内切酶对载体质粒进行线性化处理。内切酶选择可参考第二章第一节内容；

2. 目的片段和线性化载体的纯化回收：推荐使用切胶回收的方式纯化（切胶时间最好控制在3min内，避免紫外照射对DNA的伤），回收浓度使用NanoDrop/OneDrop等仪器检测，浓度应当≥20ng/μl，并跑胶鉴定是否为单一目的条带；

3. 如果回收浓度低时，可通过增加PCR/酶切反应体系，采取多管反应单管回收的方式，提高回收产物的浓度。

目的片段与线性化载体连接重组

1. 连接反应体系：按照说明书要求计算投入量，体系中各组分投入体积≥1μl，若浓度过高可稀释后使用；

2. 感受态转化涂板：连接产物转化的感受态细胞选择使用DH5α、Fast-T1等克隆用化学感受态细胞；

3. 感受态细胞不可反复冻融使用，-80°C取出后建议一次用完；

4. 重组产物体积与感受态细胞体积的比例为1:10，推荐10μl重组产物加入至100μl感受态细胞或5μl重组产物加入至50μl感受态细胞；

5. 热激时间：按照感受态细胞说明书操作进行；

6. 平板抗生素抗性：平板使用抗性与转化的载体抗性需保持一致；

7. 菌液涂板体积：将菌液离心（2500×g、3min），移液枪吸取丢弃多余LB培养基，保留100μl重悬后全部涂板；或吸取合适体积涂板。

单克隆菌落PCR鉴定

1. 挑取平板中体积大小适中的单克隆菌落，避免选择过大或过小的单克隆菌落；

2. 挑取数个单克隆菌落进行鉴定分析；

3. 挑取的菌落放入已添加10μl ddH2O的15ml或2ml EP管中溶解混匀后，吸取1-2μl作为PCR反应（10/20μl体系）模板；

4. 推荐使用一对分别位于片段和载体的上下游引物进行PCR鉴定。

常见问题分析

1. 引物同源臂设计错误：长度（不计算酶切位点）应为15-20bp之间，过长或过短均影响重组效率；GC含量以40-60%之间最适，超出范围会影响重组效率。建议使用CEDesign在线设计；

2. 重组反应体系不符合要求：片段和线性化载体的总长度不应超过20kb，应当切胶回收且回收浓度不低于20ng/μl；浓度过高时需稀释使用，保证体系投入体积不小于1μl；投入量按照下表公式计算；

3. 连接反应不适当：反应应在PCR仪中进行，温度、时间设置按照说明书进行，当同源臂GC含量超过60%或连接片段数较多时，可延长至30min，其中C112/C113可将温度时间改为50°C 15min；

4. 阳性对照反应：使用试剂盒中提供的线性化载体和插入片段，按说明书配制重组反应体系，以排除其他实验材料及操作因素的影响；

5. 转化涂板操作不当：感受态细胞应选用DH5α、Fast-T1等克隆用化学感受态细胞，不可使用电击感受态细胞；重组产物体积与感受态体积的比例为1:10；热激时间按照感受态细胞说明书操作；平板使用抗性与载体抗性保持一致；涂板前将菌液离心（2500×g，3min），移液枪吸取丢弃多余LB培养基，保留100μl重悬后全部涂板。