葡萄的品质常常受到低温胁迫的影响，而具有耐寒特性的野生山葡萄（Vamurensis）中的冷响应基因及其调控机制对于葡萄的遗传改良发挥了关键作用。WRKY转录因子在冷胁迫响应过程中起着重要作用，它通过结合W-box元件来调控次生代谢和碳水化合物的合成等多种生物过程。在葡萄中，VaWRKY65能够激活β-淀粉酶（VaBAM3），该酶负责将淀粉分解为可溶性糖，从而调节细胞的渗透压与结构稳定性，并直接调控过氧化物酶（VaPOD36）以清除活性氧（ROS），增强植物的耐寒性。然而，VaWRKYs在葡萄耐寒中的具体功能及其机制仍需深入探讨。

近期，《Horticulture Research》刊登的一项研究表明，VaWRKY65在冷胁迫下通过调控碳水化合物代谢和抗氧化机制，显著提升了葡萄的耐寒性。具体而言，VaWRKY65会激活VaBAM3，以促进可溶性糖的积累并调节渗透压；同时，它还能够激活VaPOD36的转录，从而清除活性氧（ROS），为植物提供双重的耐寒保障。

研究结果表明，通过在烟草叶片中瞬时表达由VaBAM3启动子驱动的荧光素酶（LUC）报告基因，可以检测到VaBAM3启动子的活性在冷处理下显著升高。该研究采用酵母单杂交筛选法和双荧光素酶报告基因分析，揭示了VaBAM3在冷胁迫下的调控机制，结果表明VaWRKY65通过增强VaBAM3启动子活性来调控耐寒性，而启动子的突变则会抑制此增强效果。

此外，研究还揭示了VaWRKY65在冷胁迫下对ROS的调控机制。结果表明，VaWRKY65结合并激活VaPOD36表达，进而上调VaPOD36以提高POD酶活性，增强抗氧化能力，从而有效减少ROS的积累，进而提升植物的耐寒性。

使用双荧光素酶系统实验中，研究者将基因启动子片段与pGreenII-0800-LUC载体融合后转入根瘤农杆菌GV3101，再将其或空载体转入本氏烟草叶片。在培养2天（25℃）后，进行低温处理72小时（4℃）。在观察LUC荧光时，喷洒1mM的D-荧光素溶液，置于黑暗中5分钟后，用勤翔IVScope7000植物活体成像系统检测发光并分析数据。

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