实验原理

在细菌的生物医疗研究中，芽胞因其厚重且致密的细胞壁，显示出较低的透性和较难着色的特性。通过一般的染色方法，往往只能实现菌体显色，而芽胞则保持无色透明。芽孢染色法正是基于这一特性而设计，旨在利用芽胞难以染色并且染色后不易脱色的特点。所有芽孢染色方法的核心原则在于：除了使用强染色能力的染料外，还需加热以促进芽胞的着色。在染色过程中，菌体会同时被染色，经过水洗后，芽胞的颜色难以流失，而菌体则会脱色。最后，使用对比强烈的染料对菌体进行复染，使得菌体和芽胞呈现不同的颜色，进而突显芽胞，便于观察。

实验器材

1. 活材料：培养36小时的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或枯草杆菌（Bacillus subtilis）。
2. 染色液和试剂：5%孔雀绿水溶液、0.5%番红水溶液。
3. 器材：小试管（75mm×10mm）、烧杯（300mL）、滴管、玻片搁架、接种环、擦镜纸、镊子及显微镜等。

实验方法

1. MILE米乐改良的Schaeffer与Fulton染色法：
（1）制备菌液：在小试管中加1-2滴无菌水，用接种环从斜面挑取2-3环的菌体，充分打匀，形成浓稠的菌液。
（2）加染色液：向小试管中加入2-3滴5%孔雀绿水溶液，用接种环搅拌混合。
（3）加热：将试管浸入沸水浴中，加热15-20分钟。
（4）涂片：用接种环取数环菌液于洁净载玻片上，制成涂面，晾干。
（5）固定：将涂片在酒精灯火焰中经过3次处理。
（6）脱色：用水冲洗至流出水中无孔雀绿颜色为止。
（7）复染：加蕃红水溶液染色5分钟，倾去染色液，直接用吸水纸吸干。
（8）镜检：经历低倍、高倍，再用油镜观察。

结果显示，芽胞呈绿色，而芽胞囊和菌体则为红色。

2. Schaeffer与Fulton染色法：
（1）涂片：按常规方法制备待检细菌涂片。
（2）晾干固定：涂片晾干后，经过酒精灯火焰处理2-3次。
（3）染色流程：
① 加染色液：在涂片上加入5%孔雀绿水溶液，确保染料铺满涂片。将涂片置于铜板上，用酒精灯火焰加热，直到染液冒蒸汽开始计时，维持15-20分钟，加热过程中及时补充染色液，确保样本不干涸，且避免加热温度过高。
② 水洗：待玻片冷却后，用水轻轻冲洗，直至流出水无染色液。
③ 复染：用蕃红液染色5分钟。
（4）水洗、晾干或吸干。
（5）镜检：从低倍跳到高倍，最后使用油镜观察芽胞与菌体的形态。

结果同样显示，芽胞为绿色，菌体则为红色。

注意事项

1. 用于芽胞染色的菌种应控制在适当的菌龄。
2. 改良染色法在节约染料、简化操作和提高标本质量方面优于常规涂片法，建议优先选用。
3. 在实施改良法时，为确保优质涂片，需首先准备浓稠的菌液，取出染色菌液时应先充分搅拌，避免菌体沉淀底部，以免涂片时菌体数量不足。