MILE米乐细胞培养指南

培养条件

细胞培养所需条件为DMEM培养基，添加10%胎牛血清（FBS）及1%青霉素-链霉素（P/S），并确保贴壁培养。培养温度应保持在37℃。在首次传代时建议按1:2的比例进行。传代后2天需更换培养液。建议同一时间购买MILE米乐的细胞和培养基，以获取更优惠的优惠措施。

细胞接收及处理

收到细胞后，首先用75%酒精对细胞瓶外部进行消毒，之后在超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3至4小时，以便稳定细胞状态后再进行处理。观察细胞生长情况，使用显微镜拍摄不同倍数的照片（建议在40x、100x和200x进行拍照），前三天的照片将作为售后的重要依据，如无照片提供则默认细胞状态良好。

细胞传代步骤

贴壁细胞传代

如果细胞未超过80%汇合度，需将瓶内完全培养液收集至离心管中，保留5ml培养基，并在37℃、5% CO2孵箱中培养。如果细胞密度超过80%，即可进行传代。传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS洗涤细胞1到2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，放入37℃培养箱中消化1到2分钟，显微镜下观察，如果细胞大多数变圆并脱落，迅速返回操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上的完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，然后将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清，加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2的比例将细胞悬液分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。

悬浮细胞传代

悬浮细胞的传代步骤如下：

1. 采用半换液法，将培养瓶竖立在培养箱中静置约1小时，轻轻吸去约3ml培养基，并补充3ml完全培养基。如果培养基变色不明显，可以直接加入500μl左右的FBS，传代时可以直接补充5ml培养基并分成两个培养瓶，通常经过3次这样的传代后可进行一次离心以去除死细胞。
2. 离心换液法：如果需要分瓶，将细胞悬液收集到离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液后重悬混匀，再按1:2的比例分到新的T25瓶中，添加6-8ml新配置的完全培养基以保持细胞生长活力，后续传代可以根据实际情况按1:2至1:5的比例进行。

细胞冻存

细胞冻存步骤如下：

1. 当细胞覆盖培养瓶80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，并用PBS清洗细胞一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，观察细胞变圆后立即加入5ml完全培养液以终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，随后将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。
3. 弃去上清液后，沉淀的细胞加入1ml的无血清冻存液（推荐MILE米乐的冻存液），混匀后转移至冻存管中。
4. 将冻存细胞直接放入-80℃的冰箱中保存。如需后期转入液氮罐，则需要在-80℃中存放超过24小时后再转入液氮罐。

细胞复苏

细胞复苏的步骤如下：

1. 从液氮中取出细胞冻存管（确保佩戴防护面具），迅速将其放入37℃水浴中解冻，至冻存管中无结晶后，用75%的酒精擦拭冻存管外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟。
3. 弃去上清液，沉淀的细胞用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中继续培养。
4. 第二天，换用新鲜的完全培养基继续培养。

注意事项

需要注意的是，有些细胞在运输过程中可能会脱落，这是正常现象。若脱落较多，可以将培养瓶中的培养液收集至离心管中，进行1000RPM离心5分钟，收集上清作为过渡培养液。随后沉淀细胞加入1-2ml胰酶，轻轻吹打重悬，消化1到2分钟后加入5ml完全培养基以终止反应。之后再次离心，弃去上清，加1-2ml完全培养基重悬，然后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。

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